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MIRA結(jié)合Cas12a快速檢測(cè)兒童呼吸道疾病

        急性呼吸道感染是兒童常見的呼吸道疾病，通常由病毒引起。呼吸道合胞病毒（RSV）和呼吸道腺病毒（ADV）是引起兒童急性呼吸道感染的兩種常見病原體。輕度者可引起常見的感冒癥狀，如咳嗽和流鼻涕，而嚴(yán)重者可出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，如肺炎和中耳炎。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的建議，病原體的檢測(cè)需要具備快速、準(zhǔn)確、敏感、特異性的特點(diǎn)，不應(yīng)依賴專門的技術(shù)人員或大型儀器。因此，開發(fā)一種能夠滿足上述檢測(cè)要求的RSV和ADV的檢測(cè)方法尤為重要。深圳兒童醫(yī)院兒科研究所的馬東禮主任課題組在《Scientific Reports》期刊上發(fā)表文章《A multiplex recombinase polymerase amplification assay combined with CRISPR/ Cas12a for the detection of respiratory syncytial virus and respiratory adenovirus》，影響因子4.6。

 

研究概述

將多酶恒溫快速核酸擴(kuò)增技術(shù)MIRA與CRISPR/Cas檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合。通過(guò)設(shè)計(jì)MIRA引物和CRISPR rna（crRNAs），多序列比較，優(yōu)化反應(yīng)條件，并使用熒光數(shù)值檢測(cè)裝置，驗(yàn)證靈敏度和特異性。并且以qPCR結(jié)果作為比較對(duì)照，研究了160例臨床咽拭子樣本的檢測(cè)結(jié)果的一致性。

 

（MIRA-CRISPR/Cas12a檢測(cè)法檢測(cè)步驟示意圖）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.MIRA-CRISPR/Cas12a檢測(cè)方法靈敏度和特異性

在MIRA方法檢測(cè)中，使用RSV-F1/R1引物對(duì)從RSV、ADV、PIV、RhV、MP、CP、FluB、hMPV、FluA或RSV/ADV合并感染患者的咽拭子樣本中擴(kuò)增核酸。除RSV和ADV有擴(kuò)增條帶，其他結(jié)果均為陰性，說(shuō)明所選MIRA引物與檢測(cè)的其他8種病原體未發(fā)生交叉反應(yīng)，且保守性良好。隨后，使用無(wú)菌水對(duì)RSV和ADV重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，對(duì)RSV和ADV的檢測(cè)限均為106copies/mL。

 

（1-10：分別為RSV、RSV/ADV合并感染患者咽拭子樣本以及其他呼吸道病原體樣本）

 

（1-6：107至102稀釋質(zhì)粒DNA；7：陰性對(duì)照）

2.與qPCR做對(duì)比

與qPCR方法相比，RSV和ADV的檢出限均為103copies/mL。

 

（qPCR檢測(cè)RSV和ADV的靈敏度）

MIRA-CRISPR方法更適合基層實(shí)驗(yàn)室，檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需大型qPCR儀器即可完成實(shí)驗(yàn)操作。

3.臨床樣本對(duì)比

從急性呼吸道感染的兒童中采集咽拭子樣本160例。同時(shí)使用MIRA-CRISPR方法、qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，并將結(jié)果與臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。與qPCR方法相比，MIRA-CRISPR方法對(duì)RSV和ADV的敏感性分別為98.1%和91.4%，檢測(cè)特異性均為100%。Kappa值大于0.95，表明其一致性程度較高。

 

 MIRA-CRISPR方法對(duì)RSV和ADV的檢測(cè)具備快速、靈敏、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。它能及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)到病毒感染，更加適合于醫(yī)療資源匱乏的地區(qū)使用。

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安普未來(lái)生物介紹

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安普未來(lái)多酶恒溫快速核酸擴(kuò)增技術(shù)MIRA技術(shù)在恒溫39°C-42°C下核酸擴(kuò)增，反應(yīng)時(shí)間僅為5-20 min。此外，不需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件，應(yīng)用場(chǎng)景多元化：綜合醫(yī)院檢驗(yàn)科、基層醫(yī)療、居家檢測(cè)、田間地頭等。

試劑產(chǎn)品形態(tài)多樣化：凍干粉、凍干微球等；顯示結(jié)果的多樣性：凝膠電泳、熒光曲線、膠體金試紙條等。試劑性能穩(wěn)定、便于操作、方便存儲(chǔ)運(yùn)輸。

并且安普未來(lái)生物以MIRA為核心平臺(tái)技術(shù)研發(fā)出“超快速核酸釋放技術(shù)”、“雙通道恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀”、“自測(cè)型核酸檢測(cè)裝置”等一系列配套產(chǎn)品，打造快速分子檢測(cè)整體解決方案。

 

RPA試劑盒及試紙條系列：

貨號(hào)

產(chǎn)品

規(guī)格

JY0209

雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）

50T

JY0201

單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）

50T

JY0307

Tiosbio? CRISPR單酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試紙條

50T

JY0301

CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條

50T

JY0308

Tiosbio? CRISPR雙酶切檢測(cè)試紙條（變色龍）

50T

WLB8201KIT

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型）

48T

WLE8202KIT

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型）

48T

WLN8203KIT

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型）

48T

WLRB8204KIT

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型）

48T

WLRE8205KIT

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型）

48T

WLRN8206KIT

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型）

48T

WLB5001

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體基礎(chǔ)型）

100T

WLN5002

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體膠體金型）

100T

WLR5003

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體熒光型）

100T

WLRB5001

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體基礎(chǔ)型）

100T

WLRN5002

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體膠體金型）

100T

WLRE5003

RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體熒光型）

100T

 

Cas酶系列

貨號(hào)

包裝規(guī)格

中文名稱

32108-01

100 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32108-03

1,000 pmoL

LbCas12a (Cpf1)

32117-01

100 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32117-03

1,000 pmoL

LwaCas13a (C2c2)

32118-01

100 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32118-03

1,000 pmoL

AapCas12b (C2c1)

32119-01

100 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32119-03

1,000 pmoL

Un1Cas12f1 (Cas14a1)

32104-01

100 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32104-03

1,000 pmoL

AsCas12a (Cpf1)

32116-01

100 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32116-03

1,000 pmoL

AacCas12b (C2c1)

32106-01

100 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32106-03

1,000 pmoL

FnCas12a (Cpf1)

32110-01

100 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32110-03

1,000 pmoL

Lb5Cas12a (Cpf1)

32101-01

100 pmoL

SpCas9

32101-03

1,000 pmoL

SpCas9

32102-01

100 pmoL

Sp-dCas9

32102-03

1,000 pmoL

Sp-dCas9

32120-01

100 pmoL

Sp-nCas9（H840A）

32120-03

1,000 pmoL

Sp-nCas9（H840A）