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        登革病毒（DENV）是一種通過(guò)蚊子傳播的病毒，在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛流行。它就像一個(gè)隱藏在暗處的 “健康殺手”，全球每年有超過(guò) 390 萬(wàn)人感染，約 2.5 萬(wàn)人因此失去生命。DENV 有 4 種血清型，分別是 DENV-1、DENV-2、DENV-3 和 DENV-4，每種血清型還包含多種基因型，這使得它的 “身份” 復(fù)雜多變。感染 DENV 后，患者的癥狀輕重不一，從輕微的登革熱到嚴(yán)重的登革出血熱和登革休克綜合征，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。

目前，還沒(méi)有針對(duì) DENV 的有效疫苗和特效治療藥物，因此早期檢測(cè)就顯得尤為重要。然而，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和實(shí)時(shí)定量 RT-PCR（qRT-PCR）等，存在著諸多不足。這些方法要么依賴特定的 DENV 抗體、昂貴的設(shè)備，要么需要專業(yè)技術(shù)人員操作，在資源有限的地區(qū)難以推廣使用。

為了解決這些問(wèn)題，海軍軍醫(yī)大學(xué)的研究人員開(kāi)展了一項(xiàng)關(guān)于登革病毒檢測(cè)的研究。他們將重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）技術(shù)與成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）及相關(guān)蛋白 12a（CRISPR/Cas12a）系統(tǒng)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出了一種新型的一鍋法通用 DENV 檢測(cè)系統(tǒng)，并建立了相應(yīng)的基于 RT-RPA-CRISPR/Cas12a 的側(cè)向流動(dòng)試紙條（LFD）檢測(cè)平臺(tái)。

在這項(xiàng)研究中，研究人員用到的主要關(guān)鍵技術(shù)方法包括：基于 DENV 基因組保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和 Cas12a crRNA；利用商業(yè)化試劑盒進(jìn)行 RT-RPA 反應(yīng)和 CRISPR/Cas12a 檢測(cè)反應(yīng)；通過(guò)核酸提取、質(zhì)粒稀釋等操作進(jìn)行靈敏度和特異性分析；使用側(cè)向流動(dòng)試紙條進(jìn)行可視化檢測(cè) 。

研究結(jié)果如下： 

工作流程與體系構(gòu)建：建立了一鍋法 RPA CRISPR/Cas12a 檢測(cè) DENV 的工作流程。先從感染樣本中提取核酸作為模板，用基于 DENV 四種血清型保守區(qū)域設(shè)計(jì)的通用引物進(jìn)行 RT-RPA 擴(kuò)增，再將 CRISPR/Cas12a 檢測(cè)反應(yīng)體系通過(guò)離心與擴(kuò)增產(chǎn)物混合，利用 FAM 標(biāo)記的單鏈 DNA 報(bào)告分子進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程 40 分鐘內(nèi)完成，并成功建立了 LFD 平臺(tái)。

引物和 crRNA 篩選：設(shè)計(jì)合成 2 條正向和 7 條反向 RPA 引物，經(jīng)篩選，F(xiàn)1/R1 引物對(duì)擴(kuò)增效果最佳；設(shè)計(jì) 4 種 crRNA，評(píng)估后 crRNA2 性能最優(yōu)。

反應(yīng)條件優(yōu)化：對(duì) Cas12a 和 crRNA 濃度進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn) 500 nM Cas12a 和 1000 nM crRNA 時(shí)檢測(cè)反應(yīng)熒光強(qiáng)度最高；確定 38℃為最佳反應(yīng)溫度。

靈敏度和特異性分析：該檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)限（LOD）為 91.7 copies/test；對(duì) 26 個(gè)病毒感染細(xì)胞樣本檢測(cè)，能準(zhǔn)確識(shí)別所有 DENV 陽(yáng)性樣本，與其他 4 種干擾病毒無(wú)交叉反應(yīng)，特異性達(dá) 100%。

檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證：用合成的包含 DENV-1 至 DENV-4 核酸序列的重組質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，證明該平臺(tái)可成功識(shí)別 4 種 DENV 血清型；LFD 平臺(tái)也能準(zhǔn)確識(shí)別 4 種 DENV 血清型，確定 25 nM 為 ssDNA 報(bào)告分子的合適濃度，其檢測(cè)靈敏度約為 250 copies/test。 

研究結(jié)論和討論部分指出，該一鍋法 RT-RPA-CRISPR/Cas12a 檢測(cè)系統(tǒng)對(duì) DENV 檢測(cè)具有高特異性和靈敏度，且無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果。相比傳統(tǒng)方法，它無(wú)需復(fù)雜設(shè)備，檢測(cè)時(shí)間短，能降低交叉污染風(fēng)險(xiǎn)，減少誤診。該系統(tǒng)不僅能檢測(cè)所有 4 種 DENV 血清型，在臨床登革熱檢測(cè)中具有應(yīng)用潛力，而且 LFD 平臺(tái)成本低、操作方便，在資源有限地區(qū)有很大的應(yīng)用前景，為即時(shí)檢驗(yàn)（POCT）和體外診斷（IVD）產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了支持 。不過(guò)，CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)不能忽視，后續(xù)還需進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化?？偟膩?lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究為 DENV 檢測(cè)提供了新方法，也為其他人類病毒檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)提供了思路，相關(guān)研究成果發(fā)表在《BMC Microbiology》上。

相關(guān)產(chǎn)品：RPA試劑盒及試紙條系列：

Cas酶系列